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荧光定量PCR的关键步骤说明

发布时间:2022-03-16浏览:135次

   PCR是1984年开始出现的一项基因检测技术,由于PCR技术具有简便易行、敏感度高等优点,该技术被广泛应用于基础研究和临床检测,成为分子生物学必要的研究工具。传统的PCR定量是应用终点PCR来对样品中的模板量进行定量,通常用凝胶电泳分离,并用荧光染色来检测PCR反应的扩增产物。但在PCR反应中,由于反应体系和反应条件等因素会影响PCR反应效率,甚至出现一些非特异性扩增产物。因此,用终点PCR法来定量并不准确。

  荧光定量PCR是1996年推出的一种新的定量技术,该技术克服了PCR法进入平台期后定量的较大误差问题,实现DNA/RNA的定量,而且具有敏感度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、实时和准确等特点,该技术在医学临床检验及临床医学研究方面都有着重要的意义。
  荧光定量是通过杀灭荧光源,使试剂发出荧光,从而诱导对应的dna的复制,从而检测到dna的结构变化,他的荧光源一般是react荧光抗体,目前在荧光定量的实验中使用react检测基因序列的变化。可以用来检测转录组、信号通路组、外显子组的转录或翻译能力的变化等,这些转录组数据以及信号通路的数据将决定在荧光实验方面的分析结果,特别是基因组dna的反转录活动,在转录组数据分析中具有一定的重要意义。
  荧光定量PCR操作的关键在于RNA的抽提和引物的设计。RNA的抽提需要严格进行RNasefree的操作,抽提的RNAOD260/OD280需严格控制在1.9-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高,进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现,尽量选取GC含量在40-60%的区段进行扩增。另外,还需要适应荧光定量PCR仪上机条件的设定,退火温度在55-65°C之间。除此之外,其他各个环节如试剂的稳定性,RNA反转的质量好坏,PCR上机条件的设定,加样的手法和熟练度等等也要注意。

 

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