快速荧光PCR仪作为分子诊断与基因检测的核心设备，凭借30–60分钟内完成扩增、多通道同步检测及高灵敏度定量能力，广泛应用于临床检验、疾控筛查、科研及食品安全领域。其高性能依赖于严谨的操作流程，任何环节疏漏都可能导致假阴性、假阳性或仪器损伤。掌握快速荧光PCR仪科学、规范的使用方法，是实现加样准、扩增稳、结果真的关键保障。
一、实验前准备
查试剂与耗材：确认引物/探针无降解，MasterMix未反复冻融，使用低吸附PCR管/板；
查样本质量：核酸纯度（A260/A280≈1.8–2.0）、浓度达标，避免抑制剂残留；
查仪器状态：开机预热10分钟，执行空白校准（无模板对照），清洁样品槽与热盖。
二、反应体系配制与加样规范
在冰上配制反应液，减少非特异性扩增；
使用带滤芯吸头，防止气溶胶污染；
加样后轻弹管壁混匀，短暂离心（≤500×g，5秒）去除气泡，严禁剧烈震荡；
每块板设置阴性对照（NTC）和阳性对照，确保结果可信。
三、仪器参数设置要点
选择匹配的耗材类型（如96孔全裙边板），避免热传导不良；
设定准确的荧光通道：根据所用染料（FAM、HEX、ROX等）勾选对应检测通道；
优化采集点：通常在延伸末期采集荧光，熔解曲线需设置升温速率（如0.3℃/s）；
启用热盖功能：温度设为105℃，防止冷凝水影响光学检测。
四、运行与监控
放置PCR板时对准定位标记，确保与温控模块贴合；
关闭舱门后启动程序，运行中勿频繁开盖，避免温度骤变；
实时观察扩增曲线趋势，若出现异常平台或延迟，可初步判断样本问题。
五、结果分析与数据导出
自动计算Ct值，结合标准曲线进行绝对/相对定量；
熔解峰单一且尖锐，表明扩增特异性良好；多峰提示引物二聚体或非特异产物；
数据导出为CSV或PDF格式，保留原始曲线以备复核。
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